以后，又被国民党中央任命为黄埔军校政治部主任。
从那时起，周恩来便开始了与蒋介石的合作共事。
身为黄埔军校校长的蒋介石个性褊狭，视军校为自己的势力范围，极力培植私人势力，蓄谋排斥和打击共产党人。
周恩来富有成效的政治工作，使原先死气沉沉的黄埔军校，变得生机勃勃，充满浓郁的革命气氛，自然也招来蒋介石的嫉恨和仇视。
以共产党员、共青团员和进步青年为骨干的中国青年军人联合会刚刚在周恩来指导下成立，蒋介石就指使他的得意门生贺衷寒、胡宗南等组织孙文主义学会，与青年军人联合会唱起了对台戏。
1926年3月20日，蒋介石捏造中山舰“企图叛乱”罪名，突然扣押中山舰，逮捕舰长、共产党员李之龙，并包围苏联顾问鲍罗廷的住所，解除省港罢工工人纠察队的武装，向毫无准备的共产党人发起了突然袭击。
周恩来和中共广东区委对蒋介石的野心和阴谋早有察觉。
1926年1月，周恩来从东征途中返回广州，就同中共广东区委书记陈延年等商定，准备采取打击右派、孤立中派、扩大左派的政策，给蒋介石以牵制和反击。这时，周恩来因需集中精力领导军事工作，已改任广东区委常委兼军事部长。
他们把意见报告给远在上海的中共中央总书记陈独秀，不料却接到陈独秀一纸坚决不同意的电文。
见面之际，周恩来发现蒋介石同右派来往密切，神色紧张，便把情况告诉给苏联顾问当翻译的广东区委宣传部长张太雷。
这时，苏联顾问鲍罗廷不在广州，只留下季山嘉。季山嘉也和中共中央一样，对蒋介石的阴谋充耳不闻。
3月20日清晨，周恩来得到事变的消息，立即赶到造币厂找蒋介石。
刚走近造币厂，随周恩来同来的4个警卫就被缴了械。
周恩来不顾卫兵的阻拦，径直走进蒋介石的房间，向他提出质问，要求立即释放被捕的共产党人。
蒋介石竟然将周恩来也软禁了一天。
以陈独秀为首的中共中央，对蒋介石的进攻采取妥协让步政策，已暴露身份的250名共产党员被迫退出蒋介石控制的国民革命军第一军和黄埔军校。
周恩来的第一军副党代表兼黄埔军校政治部主任的职务也被蒋介石解除。
“走开，走开！”一阵凶狠的喝叱声，打断了周恩来的回忆。
轮船已到南京，刚刚停稳，一队全副武装的士兵就拨开人群，闯进船舱，开始例行的检查。
周恩来平静地面对搜查的士兵。一阵蛮横的翻箱倒匣之后，士兵们退出船舱。
钟山巍峨，秦淮逶逦。古都南京以它不变的迷人风姿，吸引了千百年来的文人墨客、商贾行旅。
而此时，周恩来却感到了一股肃杀之气。
从1926年3月中山舰事件发生到1927年4月南京反动政府建立，蒋介石的羽翼迅速丰满，最终走到了大革命和人民的对立面。
南京政府金碧辉煌的殿字楼阁，沾满了共产党人和革命群众的淋漓鲜血。
是中国共产党的一再迁就和妥协，帮助了蒋介石。
1926年7月以后，随着北伐军的节节胜利，作为北伐军总司令，蒋介石的声名在国民党内迅速攀升。虽然他率领的第一军纪律败坏，毫无战功可言。
1927年3月，蒋介石指使江西的反动分子杀害赣州总工会主席、共产党员陈赞贤。
当陈赞贤被害的消息传到上海，身为上海工人第三次武装起义总指挥的周恩来，正冒着枪林弹雨，在起义的前沿阵地检查工事。
1926年12月，周恩来奉调从广州来到上海，名义上是中共中央组织部秘书，实际上却负责整个党的组织工作。
1927年2月，上海工人第二次武装起义失败后，富于军事工作经验的周恩来便被调去负责第三次起义的组织指挥工作。
在准备和发动这次起义的日日夜夜，周恩来宵衣旰食，费尽了才思和心力。
3月19日，周恩来在上海区委主席团召开的紧急会议上，指出宜兴已下，敌毕庶澄部有败退可能，应及时采取行动。
两天后的中午，上海80万工人在震天的汽笛声中开始总罢工，数千名工人纠察队员在周恩来等人指挥下，正式发动武装起义。
下午4时，周恩来接到毕庶澄部准备从吴淞口逃跑的情报，当即组织工人纠察队于途中阻击。
黄昏时刻，周恩来出现在宝山路中段攻打敌军需处的起义工人中间。在察看周围地形以后，他指示工人“围而不打”，待敌人一露头，立刻展开攻击。
3月22日，周恩来来到攻打北火车站的前沿阵地，一面指挥工人纠察队抢救被大火包围的居民财物，一面组织加强前线火力配备，严密监视敌人动向。
这时，一颗炮弹突然从天而降，飞溅的泥土落满周恩来全身。他掸掸身上的泥灰，又继续在阵地上巡视指挥。
这一天下午，毕庶澄看到大势已去，悄悄换上便服逃进租界。北火车站被工人纠察队攻克。胜利的欢笑声在黄浦江畔回荡。就在上海工人冒死与军阀部队激烈战斗的时候，隐藏在革命队伍内部的反革命分子却把枪口悄悄地对准了革命者。
国民革命军东路军前敌总指挥白崇禧率领的北伐军，已推进到上海南郊龙华，却在上海总工会代表要求他们迅速出兵援助之时，借口“军队初到，很疲困”而逡巡不前，作壁上观。
一直在暗中注视上海工人一举一动的蒋介石，此时也坐卧不宁，寝食难安。
3月26日，上海战场上的硝烟刚刚散尽，蒋介石便急忙乘军舰从江西赶到上海。
他一到上海，就要求上海总工会解除工人纠察队的武装。【贺氏藏书·刘大海精校】
蒋介石的无理要求遭到上海总工会的严辞拒绝后，又马上扮出一副笑脸，派人敲锣打鼓给上海总工会和工人纠察队送去一面上书“奋斗到底”的锦旗。
蒋介石的不正常举动，引起了周恩来的密切注意。
早在3月25日，周恩来就将白崇禧调开薛岳师，调来刘峙部，即将谋划解决纠察队的消息报告了中央。
3月30日，周恩来在中共中央和上海区委联合组织的特委会上再次报告：“整个的情形，他们对付我们已有准备。”
在上海和武汉，中共党内许多同志如赵世炎、罗亦农、吴玉章、瞿秋白等曾紧急商讨过如何对付蒋介石在沪宁一带异动的问题，主张从武汉调第四军赶到南京，配合尚未开往江北的第二、六两军，加强南京一带防务，监视蒋介石。
但是，不了解中国革命形势的共产国际，此时却仍对蒋介石抱着希望和幻想。于是，一封不准与蒋介石决裂的指示信从遥远的莫斯科寄到了中国。
就在这时，一位为各派政治势力所瞩目的人物回到了国内。他就是汪精卫。
这位前广州国民政府主席自1926年4月以治病为名远走法国以来，一直郁郁不乐，对蒋介石耿耿于怀。
他等待着东山再起，与蒋介石一争雌雄。
1926年11月，国民党左派和共产党因不满蒋介石的专横跋扈，首先提出了“迎汪复职”的口号。1927年3月，国民党二届三中全会前后，请汪精卫回国的呼声达到高潮。
而此时与武汉国民政府背道而驰的蒋介石，也为了共同分共的需要，连电汪精卫尽早归国。
在一片“迎汪复职”的呼声中，汪精卫于4月1日翩然抵达上海。
对汪精卫，周恩来的印象一言难尽。
早年的汪精卫，曾参加同盟会，在谋刺清摄政王载沣被捕后，在狱中写下了“慷慨歌燕市，从容作楚囚”的诗句，可谓意气淋漓，豪情奋发。
大革命中期，汪精卫以国民政府主席身份，被共产党视为左派领袖人物。汪精卫也俨然以此自居。
对汪精卫的如期归来，中共中央总书记陈独秀和苏联顾问鲍罗廷寄予了莫大的希望。
4月5日，陈独秀便与汪精卫一起发表《汪陈联合宣言》。
在宣言中，陈独秀一面说“共产党组织工人政府，将冲击租界、打倒国民党”的传闻纯属谣言，一面又极力为“国民党领袖将驱逐共产党，将压迫工会与工人纠察队”的消息辩护。
在蒋介石加紧其反革命行动的紧急时刻，《汪陈联合宣言》犹如一颗烟幕弹，掩盖了蒋介石反革命的真实面目。
4月12日，蓄谋已久的反革命政变终于拉开了黑幕。
事变前一天晚上，周恩来应二十六军二师师长斯烈邀请，来到位于宝山路天主教堂的二师司令部。
刚跨进大门，斯烈便满脸堆笑迎了出来。
谈话进入正题，斯烈却躲躲闪闪，顾左右而言他。周恩来忽地站起身来，转身朝大门走去。
斯烈见状，急忙大跨几步，挡在周恩来面前，脸上的笑容也突然消失。几个武装士兵冲上来，挡住了周恩来的去路。
此时，周恩来已经完全明白了他们的阴谋。